蔣介石和周恩來，曾是志同道合的同事，卻越走越遠，成為唇槍舌劍的政敵。美國前總統尼克森在其著作《領袖們》一書中，這樣形容周恩來與蔣介石之間的關係，「周恩來與蔣介石之間的關係，就像在公園裡乘坐滑車一樣，時起時落。」

1924年6月，孫中山創辦黃埔軍校，任命蔣介石為校長。當時黃埔軍校特設政治部，負責政治思想教育。剛開始，孫中山任命戴季陶為政治部主任，可戴季陶反對國共合作，悄悄溜回上海，所以政治部主任職位由副主任邵元沖代理，但邵元沖的演講被學生們戲謔是「催眠術」。當時的中國，國勢日頹，留洋在外的許多優秀共產黨人紛紛被召回國加入到國共合作的大潮流中，舉起了反帝反封建反軍閥割據的大旗。周恩來也於1924年9月初來到廣州，應邀進入黃埔軍校，兼任軍校的政治教官，講授政治經濟學，從此開始了他與蔣介石之間磕磕碰碰、長達二十多年的交往生涯。

周恩來上任後，經過一番大力整頓，使政治部的工作很快進入正軌，出現了新的氣象。他還支持進步學生建立了「血花劇社」，編演新劇，宣傳革命，使軍校充滿了革命的生機和活力，蔣介石為此稱讚他是個「導演人才」。隨著廣州周邊形勢的急劇惡化，黃埔軍校的學生們不得不暫停學業，投身於平定廣州商團叛亂和東征討伐陳炯明的戰鬥。周恩來在其中發揮了很大的鼓舞和組織領導作用。蔣介石曾對人誇耀說：「黃埔軍校里他最得力的助手，一個是周恩來，一個是鄧演達。」當時的周恩來也十分尊重蔣介石，在軍校管理和兩次東征戰鬥中，全力支持、配合蔣介石開展各項工作。

隨著實力不斷增長，蔣介石的反共面目漸露端倪。1925年11月，在東征途中，他召集連以上軍政人員聯席會議，公開表示黃埔軍校不可分裂，要求國民革命軍第一軍政治部主任、東征軍總政治部主任周恩來把所有在黃埔軍校以及在軍隊中的共產黨員的名單，和所有加入共產黨的國民黨員的名單都告訴他。作為中共黃埔軍校支部負責人，周恩來以此事關係國共兩黨，須請示中共中央才能決定為由，予以拒絕。

1926年3月20日，自感羽翼豐滿的蔣介石開始走向背叛革命的道路，一手炮製了「中山艦事件」，這是蔣介石與中國共產黨決裂的第一個信號。事變發生伊始，周恩來聞訊前往，也被軟禁於廣州鑄幣廠達一天之久。為此，他義憤填膺，在鑄幣廠打通了蔣介石的電話。蔣介石接到電話後有幾分驚慌，這次事變只是他反共排共的投石問路，蔣介石不知道國民黨內的左派和共產黨人們會採取何種反擊，因而很快下令將共產黨員釋放了。這時，周恩來已清醒地意識到，他與蔣介石之間的裂隙越來越大。

1926年7月，國共兩黨決定北伐大計，蔣介石任國民革命軍總司令。出師之前，張治中請求，讓周恩來擔任國民革命軍總政治部主任一職，以便加強兩黨的合作，蔣介石一口回絕。隨後，北伐軍總政治部主任鄧演達也向蔣介石舉薦周恩來。這使蔣介石不能不再次考慮重用周恩來的問題。其實，他自己也是打心眼裡佩服周恩來的，他感到在國民黨里，無論元老還是新秀，還沒有一個人能與之相匹敵，若能得到他的幫助，對自己將是非常有利的。 為了拉攏周恩來，蔣介石裝出一副禮賢下士的樣子，特意宴請周恩來。席間，他對周恩來和另一位作陪的共產黨員惲代英說：「你們都是我的江浙同鄉，凡是同我共過事，在一起訓練過軍隊、打過仗的共產黨人，我都以知己看待。我希望恩來兄能與我一道北伐。」周恩來婉轉地拒絕道：「此事只能由中共中央決定，我個人難以抉擇」「你真頑固呀，我本想請你開誠布公地談一談，可你……你吞吞吐吐，這樣吧，等北伐勝利歸來，你再回黃埔來。」

「四一二反革命政變」發生後，周恩來與蔣介石徹底決裂。面對蔣介石的反革命囂張氣焰，周恩來冒著腥風血雨，於1927年8月1日在南昌組織領導武裝暴動，由此走上了創建人民軍隊、武裝反抗蔣介石國民黨反動派的革命道路。而蔣介石卻在反革命的道路上越走越遠，五次「圍剿」紅軍，抗戰期間還騰出一隻手反共，並於1946年發動內戰，結果1949年兵敗大陸，偏安於台灣一隅。

1926年底,周恩來離開了奮鬥兩年多的黃埔軍校,赴上海共產黨中央擔任組織部秘書,兼中央軍委委員,秘密策划上海武裝起義,一直到1927年爆發「四一二反革命政變」,蔣介石命令軍隊大肆逮捕共產黨員,上海被屠殺者有三百多人, 上千名共產黨人被拘捕。 當時，領導上海工人舉行第三次武裝起義的周恩來亦不幸被捕。如遭遇不測，後果不堪設想。在這關鍵時刻，是一位名叫鮑靖中的黃埔軍校畢業生挺身而出救了他。幾經周折，周恩來被安全護送到火車站附近，安全脫險。

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